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本書主要內容是:採用兩步循環灌流法和多次低速離心分離、純化大鼠再生肝細胞,並原代培養大鼠再生肝細胞,用構建的重組腺病毒Ad-PLCγ2感染大鼠肝細胞;用半定量PCR、RT-qPCR和Western blotting方法分別檢測肝細胞中PLCγ2 mRNA和蛋白表達情況;用免疫熒光技術檢測PLCγ2蛋白在肝細胞中的亞細胞定位;用四甲基偶氮唑鹽(methylthiazolyltetrazolium,MTT)法檢測肝細胞增殖活性;用流式細胞術(flow cytometry,FCM)測定肝細胞的細胞週期及細胞凋亡率;用分光光度計方法檢測感染後大鼠再生肝細胞中Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的活性變化;用Westernblot方法檢測PLCγ2下游信號通路PKCDJNK的磷酸化情況,Ad-PLCγ2過表達效率高,顯著增加了肝細胞內PLCγ2 mRNA和蛋白表達。重組腺病毒Ad-PLCγ2 成功感染體外再生肝細胞,轉染效率在90%以上;肝細胞中PLCγ2 mRNA和蛋白表達顯著上調(P<0.05)。在一定範圍內,PLCγ2表達呈時間依賴性。成功構建了過表達效率高的Ad-PLCγ2重組腺病毒,PLCγ2基因顯著抑制體外大鼠肝細胞增殖,並誘導其凋亡;PLCγ2引起下游信號通路中PKCD、P38和JNK12磷酸化水平顯著增加;阻斷PKCD活性後,p-P38和p-JNK12水平顯著降低,同時肝細胞凋亡受抑制,增殖能力增強。提示PLCγ2通過PKCD介導的P38和JNK12信號通路促進大鼠肝細胞凋亡並抑制其增殖。
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