出入境檢驗檢疫行業標準彙編：動物檢疫卷(中)（簡體書）

出入境檢驗檢疫行業標準是檢驗檢疫系統技術執法的主要依據，自1992年起，檢驗檢疫系統已發佈的行業標準達3753項，現行有效的3181項。一直以來，檢驗檢疫行業標準受到了系統內外相關部門的普遍關注和使用。為了便於檢驗檢疫技術執法，更好地服務外貿，也便於生產部門和相關單位的人員在工作中及時掌握、查找和使用檢驗檢疫行業標準，組織出版《出入境檢驗檢疫行業標準彙編》叢書，它在一定程度上反映了檢驗檢疫行業標準化事業發展的基本情況和主要成就。《出入境檢驗檢疫行業標準彙編：動物檢疫卷（中）》是我國檢驗檢疫行業標準化方面的一套大型叢書，按專業分類分別立卷。本套叢書收錄了截至2011年7月1日前發佈並有效的出入境檢驗檢疫行業標準3181項，其中有36項標準因各種原因僅收錄了標準名稱。．

《出入境檢驗檢疫行業標準匯編:動物檢疫卷(中)》由中國標準出版社出版。

5 病毒的分離鑒定
5.1 試劑與材料
5.1.1 AKAV。
5.1.2 AKAv陽性血清和陰性血清：試驗前血清需經56℃滅活30 min。
5.1.3 兔抗AKAV抗體：使用時用PBS稀釋至工作濃度。
5.1.4 FITC標記的羊抗兔IgG：使用時用含0.01％伊文思藍的樣品稀釋液稀釋至工作濃度。
5.1.5 Vero細胞、BHK—21細胞或Hmlu—1細胞：使用時配制成3×105／mL細胞懸液。
5.1.6 1日～2日齡乳鼠。
5.1.7 6日～8日齡SPF雞胚。
5.1.8 病料：無菌采取流產胎兒或死胎的腦、脊髓、胎盤、肝、脾、肺、腎等器官組織。冷凍保存。
5.1.9 溶液配制：包括細胞培養液、細胞維持液、細胞分散液、PBS等。配方及配制方法見附錄B。
5.2 設備
5.2.1 倒置光學顯微鏡、熒光顯微鏡。
5.2.2 二氧化碳培養箱。
5.2.3 研缽或組織搗碎機、離心機。
5.2.4 血球計數板。
5.2.5 可調微量移液器（20μL～200 μL，100 μL～1000 μL）。
5.2.6 細胞培養瓶（5 mL）、細胞培養板等。
5.3 組織懸液制備
將病料剪碎，置研缽或組織搗碎機中研磨或搗碎，用加雙抗（含青霉素2 000 IU／mL、鏈霉素2000 μg／mL）的細胞培養液或PBS制成l0％的組織懸液，于4℃浸泡4 h，然后反復凍融3次。以3000 r／min離心20 min，取上清液保存備用。
5.4 病毒分離
5.4.1 細胞分離法
按常規方法培養細胞單層，待長至80％左右，吸去培養液，用無血清培養液洗滌1次。如用細胞培養瓶，則按1 mL／25 cm2接種組織上清液，每樣接種2瓶。如用細胞培養板，則按每孔0.1 mL接種組織上清液，每樣接種2孔。置37℃5％二氧化碳培養箱內培養。于37℃吸附1 h后吸去上清液，加細胞維持液，置37℃5％二氧化碳培養箱內培養，24 h后逐日觀察CPE，連續觀察7 d。無CPE的盲傳2代。如有CPE，則待70％細胞出現CPE時收毒，將細胞凍融2次，3000 r／min離心20 min，取上清液保存待鑒定。
5.4.2 乳鼠分離法
取1 d～2 d齡健康乳鼠，每只腦內接種組織上清液0.01 mL，每樣接種5只，每天至少觀察三次，連續觀察7 d，及時收集瀕死和發病乳鼠的腦組織。按5.3方法制成上清液供傳代或鑒定。接種第1代乳鼠未出現發病死亡的，宜用乳鼠傳代2次或再接種細胞或雞胚進一步分離。
5.4.3 雞胚分離法
用組織上清液接種6日～8日齡SPF雞胚卵黃囊，每樣接種4枚，每枚接種0.1 mL。每天早晚照蛋1次，連續7 d，棄去24 h內非特異性死亡雞胚。收獲死胚和未死亡雞胚的絨毛尿囊膜、尿囊液、腦、肝、脾、腎、肌肉組織等，有病變的以收獲病變組織為佳。按5.3方法制成上清液，供傳代或鑒定。接種第1代未出現死胚的，宜盲傳2代。