細胞培養工程（簡體書）

《普通高等教育“十一五”國家級規劃教材：細胞培養工程》以現代細胞培養技術和工程原理為基礎，圍繞動、植物細胞培養過程中的關鍵工程技術和生物學問題，論述了現代細胞培養工程的發展方向和前沿技術。《普通高等教育“十一五”國家級規劃教材：細胞培養工程》共分上、下兩篇，上篇講述細胞培養工程的基礎知識，內容涵蓋了細胞培養基本理論，動、植物細胞培養技術，細胞大規模培養及產品；下篇針對大規模細胞培養共性工程問題，闡述了大規模細胞培養過程的技術特點、反應動力學與操作模式、反應器及放大，並對動、植物細胞培養工藝開發、驗證及優化進行了詳細介紹。《普通高等教育“十一五”國家級規劃教材：細胞培養工程》對讀者熟悉並系統掌握細胞培養工程的基本原理、理論和技術方法，運用這些知識進行工程創新和開發研究具有積極的指導作用，適用於高等院校生物技術、生物工程、生物製藥等專業的本科生、研究生，也適合科研機構、企業等從事動、植物細胞培養科研開發和管理工作的人員參考。．

《普通高等教育"十一五"國家級規劃教材:細胞培養工程》對讀者熟悉并系統掌握細胞培養工程的基本原理、理論和技術方法，運用這些知識進行工程創新和開發研究具有積極的指導作用，適用于高等院校生物技術、生物工程、生物制藥等專業的本科生、研究生，也適合科研機構、企業等從事動、植物細胞培養科研開發和管理工作的人員參考。

第一章緒論第一節概述一、細胞培養工程概念及特點二、細胞培養工程研究的內容三、細胞培養工程產業化影響因素及對策四、細胞培養工程研究的意義及發展趨勢第二節動物細胞培養技術發展歷程一、動物細胞培養的歷史二、動物細胞培養的現狀及展望第三節植物細胞培養技術發展歷程一、植物細胞培養的歷史二、植物細胞培養的現狀三、植物細胞培養的展望上篇細胞培養工程基礎知識第二章細胞培養基本理論及技術第一節細胞的結構一、植物細胞結構二、動物細胞結構三、原核細胞、植物細胞和動物細胞結構的比較第二節細胞培養的生物學基礎一、細胞形態二、細胞的生長週期三、細胞的全能性四、細胞群體生長特點第三節無菌技術一、無菌操作技術二、無菌區三、消毒四、體外培養細胞無菌操作實例第四節顯微操作技術一、概述二、顯微操作實例第三章動物細胞培養技術第一節細胞株系的建立一、基本概念二、二倍體細胞系的建立三、傳代細胞系的建立四、基因工程細胞系的建立五、培養細胞活力的檢測六、細胞庫建立及注意事項第二節動物細胞培養基一、培養基的主要成分及其作用二、培養基種類三、無血清培養基四、無蛋白培養基五、培養基選擇原則六、其他常用培養基第三節細胞的凍存、復蘇和運輸一、細胞的凍存二、細胞的復蘇和運輸第四節動物細胞常用培養方法一、貼壁培養二、懸浮培養三、微囊培養第四章動物細胞大規模培養及工業應用第一節動物細胞大規模培養技術一、微載體細胞培養系統二、中空纖維細胞培養系統三、微囊培養系統第二節營養與培養條件一、營養成分二、溫度三、pH四、滲透壓五、溶氧六、攪拌七、其他因素第三節幹細胞培養技術一、幹細胞概念與分類二、胚胎幹細胞三、成體幹細胞四、神經幹細胞及其體外培養第四節動物細胞大規模培養產品一、單克隆抗體二、疫苗三、基因重組蛋白藥物第五節組織工程產品一、皮膚二、軟骨三、骨四、胰腺五、血管第五章植物細胞培養技術第一節植物細胞株系的建立一、固體培養體系的建立二、懸浮培養體系的建立第二節高產細胞株系的選育一、外植體的選擇二、離體培養細胞的變異三、突變細胞的篩選第三節植物細胞培養基一、培養基種類二、培養基的營養成分三、植物細胞生長的影響因素第四節植物細胞培養相關技術一、毛狀根培養二、原生質體融合技術三、固定化細胞培養第六章植物細胞大規模培養及產品第一節植物細胞培養過程中的生物學問題一、培養植物細胞的分裂二、細胞脫分化和再分化三、細胞聚集成團第二節營養與環境條件一、培養基組成二、pH三、光照四、溫度五、前體飼喂六、氣體組成第三節植物細胞防禦反應與次級代謝物的誘導生產一、誘導子概述二、誘導子的信使作用第四節植物細胞培養生產次級代謝物產品一、生物鹼二、類黃酮三、萜類和甾體四、蒽醌類化合物下篇大規模細胞培養共性工程問題索引．

另一種常用的人胚腎（human embryonic kidney，HEK）293細胞于1977年由Graham等用5型腺病毒75株系轉化構建的，它含有AdS E1區的人胚腎亞三倍體細胞系，是一種E1區缺陷互補細胞系。HEK293細胞是貼壁依賴型呈上皮樣細胞，表現出典型的腺病毒轉化細胞的表型，細胞允許Ad5和其他血清型腺病毒在其上增殖。貼壁培養、微載體培養和無血清懸浮培養3種方式均可用于293細胞的大規模培養。293細胞在無Ca2+或含Ca2+培養基中可同樣生長，也可生長在血清濃度較低的培養基中。HEK293細胞系具有很高的質粒轉染效率和保持外源基因的高穩定性，已成為基因轉染實驗室最常使用的細胞系之一。以HEK293為基礎衍生了一些新的HEK細胞株，如EB病毒轉化的HEK—EBNA細胞、SV40 T—抗原轉化的HEK293 T株、B淋巴瘤細胞融合的HKB—11細胞等，這些細胞株具有新的特性，成為基因轉染實驗中可供選擇的新細胞株。
2.動物細胞基因轉染技術
哺乳動物細胞表達系統包括表達載體和宿主細胞。表達載體的基因表達調控機理已研究得較清楚，構建的真核表達載體也已不少，人們可以較好地選擇不同的載體、不同的增強子和啟動子來獲得外源基因的高效表達。相對而言，對宿主細胞的研究較少，往往只是采用CHO細胞。近年來，隨著重組藥用蛋白的應用日趨廣泛，對哺乳動物細胞表達系統的研究日益深入，這種情況已有所改變。人們已發現不同的宿主細胞表達產品的產量和質量（如糖基化類型）差別懸殊。同時，不同的細胞對大規模培養和純化工藝的要求也不盡相同，因此，對宿主細胞的研究、選擇和改造已越來越受到人們的重視。在真核細胞的表達研究中，細胞轉染是一個關鍵步驟。在基因治療中，也需要用基因轉移技術導入外源基因。因此，該技術的研究已越來越受到重視，至今已開發出許多新的技術和方法。不同的細胞系，攝取和表達外源DNA的能力可相差幾個數量級，在一種細胞上行之有效的方法，在另一種細胞上可能毫無用處。因此，如果采用某種特定的細胞系，就務必比較幾種不同方法的轉染效率。
（1）光穿孔法（optoporation） 光穿孔法是利用激光產生的熱量，使細胞壁產生孔洞，將外源物質導人細胞。Palumbo等（1996）將一束藍色氬激光通過100倍物鏡作用于培養基中的細胞，在酚紅存在下可能是由于溫度的變化，受照部位細胞壁通透性增加，從而使懸浮于培養基中的DNA進入細胞。該部位直徑可由照射時間和照射強度控制，通透性持續時間很短，1～2 min內即自動消失，其間細胞無明顯傷害。光穿孔優點是：①利用培養基中常規成分酚紅作用，無須任何添加劑；②可以有選擇地對細胞進行轉染，即當有不同的細胞混在一起時，只要形態上可分，就可被光穿孔法選擇性地轉染。
（2）基因槍法 微粒轟擊又叫基因槍（gene gun）技術、生物發射技術或高速微粒子發射技術。它是借高速運動的金屬微粒，將附著于其表面的核酸分子引入受體細胞的技術，適用于動物細胞的基因轉染。
（3）電穿孔法 高脈沖電壓破壞細胞膜電位，DNA通過膜上形成的小孔導入，可穩定轉染，瞬時性轉染所有細胞，此方法適用性廣但細胞致死率高、DNA和細胞用量大，需根據不同細胞類型優化電穿孔實驗條件。
（4）陽離子性的脂質體法帶正電的脂質體與帶負電的核酸磷酸基團形成復合物，被細胞內吞而進入細胞，可穩定轉染，瞬時性轉染所有細胞。該方法適用性廣，轉染效率高，重復性好，但轉染時需除血清，轉染效果隨細胞類型變化大。