分子細胞生物學實驗指導（簡體書）

薛良義主編的《分子細胞生物學實驗指導》內容介紹：本教材分細胞生物學技術和分子生物學技術兩篇。內容上，細胞生物學技術篇包括細胞的形態結構觀察、細胞器的分離、細胞膜生理、細胞化學、細胞凋亡的檢測及細胞工程技術等；分子生物學技術篇包括核酸的提取、PCR及基因克隆、分子雜交、轉基因和蛋白質電泳等。實驗類型上，每篇都含有基礎性實驗、綜合性實驗和研究性實驗，有利于學生學習基本實驗技術以及初步訓練科學研究能力。

前言
第一篇 細胞生物學技術
實驗1 細胞形態觀察及顯微測量
實驗2 光學顯微標本的制備與觀察
實驗3 相差和熒光顯微鏡的使用
實驗4 透射電子顯微鏡及細胞超微結構觀察
實驗5 掃描電子顯微鏡及細胞表面結構觀察
實驗6 細胞骨架的觀察
實驗7 細胞核和線粒體的分離及鑒定
實驗8 葉綠體的分離與觀察
實驗9 細胞膜的通透性
實驗10 植物凝集素對紅細胞的凝集作用
實驗11 細胞電泳
實驗12 細胞吞噬的觀察
實驗13 魚類血細胞微核的誘導
實驗14 細胞內DNA及RNA的顯示
實驗15 動物細胞原代培養
實驗16 動物細胞傳代培養
實驗17 原生質體的分離和培養
實驗18 細胞凋亡的誘導和檢測
實驗19 細胞融合的誘導
實驗20 重金屬離子對魚類細胞活性的影響
實驗21 動物骨髓細胞染色體的制備
實驗22 魚類精子的超低溫冷凍保存
實驗23 單細胞凝膠電泳
實驗24 熒光原位雜交

第二篇 分子生物學技術
實驗25 魚類基因組DNA的提取
實驗26 植物基因組DNA的提取
實驗27 細菌基因組DNA的提取
實驗28 DNA酶切及凝膠電泳
實驗29 Southern雜交
實驗30 基因的PCR擴增
實驗31 感受態細胞的制備
實驗32 質粒DNA的分離、純化和鑒定
實驗33 PCR擴增產物的純化及克隆
實驗34 RNA的提取與檢測
實驗35 逆轉錄PCR法檢測基因的表達
實驗36 cDNA克隆及原核表達
實驗37 重組蛋白的檢測
實驗38 Northern雜交
實驗39 RACE技術
實驗40 定量PCR技術
實驗41 應用基因槍法進行藻類遺傳轉化
實驗42 農桿菌介導的植物遺傳轉化技術
實驗43 基因組步移
實驗44 啟動子功能分析
實驗45 蛋白質雙向凝膠電泳
實驗46 同工酶電泳分析
參考文獻
附錄 實驗室規則

實驗1 細胞形態觀察及顯微測量
【實驗目的】
學習和掌握在普通光學顯微鏡下測量細胞大小的方法。
【實驗原理】
細胞長度、面積、體積的測量是研究正常的或病理組織細胞的基本方法之一。
在顯微鏡下用來測量細胞長度的工具叫顯微測量計，由目鏡測微尺（ocularmicrometer）和鏡臺測微尺（stage micrometer）組成，兩尺要配合使用。目鏡測微尺是放在目鏡內的一直徑為2cm的圓形玻片，圓形玻片正中央有100等分格的刻度尺。
每一小格表示的實際長度隨不同的顯微鏡、不同放大倍數的物鏡而不同。鏡臺測微尺是一塊特制的載玻片，在它的中央由一片圓形蓋片封固著一具有精細刻度的標尺，標尺全長為lmm，分為l00等份的小格，每小格的長度為0.0lmm（10μm），標尺的外圍有一小黑環，便于找到標尺的位置。顯微測量時，先用鏡臺測微尺標定目鏡測微尺每小格所表示的實際長度。在測量細胞時，移去鏡臺測微尺，換上被測標本，用目鏡測微尺即可測得觀察標本的實際長度。
【實驗材料、器具和試劑】
1.材料鯽魚、蛙和人血涂片。
2.器具顯微鏡、目鏡測微尺、鏡臺測微尺。
【實驗步驟】
1.細胞大小的測量
（1）取下目鏡，將目鏡測微尺的刻度面向下放入目鏡內的視場光闌上，再旋上目鏡。
（2）將鏡臺測微尺蓋片面朝上放在載物臺上，用低倍鏡觀察，調節焦距看清鏡臺測微尺的刻度。
（3）移動鏡臺測微尺，同時轉動目鏡，使目鏡測微尺與鏡臺測微尺平行靠近，并將兩尺的“0”點刻度線或某刻度線對齊。然后從左向右查看兩尺刻度線另一重合處，分別記錄重合線間目鏡測微尺和鏡臺測微尺的格數。以下式計算目鏡測微尺每小格表示的實際長度：目鏡測微尺每小格實際長度=鏡臺測微尺格數×10μm/目鏡測微尺格數（4）移去鏡臺測微尺，換上不同生物的血涂片，用目鏡測微尺測量細胞所占小格數并乘以目鏡測微尺每小格代表的實際長度，即為被測細胞的實際長度。如果細胞是橢圓形的，分別測量其長徑和短徑。
2.厚度測量法測量細胞的厚度，最簡便的方法是利用顯微鏡上的微調焦輪上的標尺對細胞厚度進行測量。先將焦點面與被測物體的上端對齊一致，記下輪上的刻度數，然后旋轉微調焦輪，使焦點面與下端對齊一致，再記下刻度數，兩者之差，便是所測物體的厚度。此法簡單但不精確。
3.觀察細胞及細胞器的形態結構觀察和比較這三種不同生物血細胞的形態和結構。
【注意事項】
1.需要換用高倍鏡或油鏡測量時，要用同樣的方法重新計算高倍鏡或油鏡下目鏡測微尺每小格的實際長度。
2.在測量時要注意將被測物體放在視野中央，因為這個位置鏡像最清晰，相差最小。
3.每一種被測物體（細胞）需反復測量幾個或幾十個，采用其平均值。
【作業與思考】
1.各測量10個鯽魚、蛙和人紅細胞的長度和寬度，求其平均值。
2.根據測量結果寫實驗報告。
實驗2光學顯微標本的制備與觀察
【實驗目的】
理解石蠟切片法各主要步驟的基本原理，熟悉各種試劑的配制和各種器材的使用方法，學習制作動物組織切片及染色技術。
【實驗原理】
生物體大部分都是不透明的，不能直接在顯微鏡下觀察。要在顯微鏡下觀察其內部的微細結構，必須采用各種特殊的方法對材料進行處理，把材料制成玻片標本，使光線能透過，才能置于顯微鏡下觀察和了解它們的微細結構。
石蠟切片是組織學常規制片技術中應用最廣泛的方法。它不僅用于觀察正常細胞組織的形態結構，而且是病理學和法醫學等學科用以研究、觀察及判斷細胞組織的形態變化的主要方法，已相當廣泛地用于其他許多學科的研究中。
顯微制片首先要盡量保持生物材料的天然狀態，避免變形和失真。因此須將生物材料做固定處理；制片必須薄而透明，才能在光學顯微鏡下成像。除將材料切成薄片或通過輕壓或其他手段使之分散外，還需采用其他方法使其透明和染色，以便更好地觀察到結構的細節。需長期保存的制片，還應進行脫水和封固。
染色的目的是使細胞組織內的不同結構呈現不同的顏色以便于觀察。未經染色的細胞組織其折光率相似，不易辨認。經染色可顯示細胞內不同的細胞器和內含物以及不同類型的細胞組織。染色劑種類繁多，應根據觀察要求及研究內容采用不同的染色劑及染色方法，還要注意選用適宜的固定劑才能取得滿意的結果。
經典的蘇木精（hematoxylin）-伊紅（曙紅，eosin）染色法是組織學標本及病理切片標本的常規染色法，簡稱HE染色。經HE染色后，細胞核被蘇木精染成紫藍色，多數細胞質及非細胞成分被伊紅染成粉紅色。由于蘇木精是帶陽離子的染料，染液呈堿性，核內染色質及胞質內核糖體等物質對這種染料有親和性，稱嗜堿性；而帶陰離子的伊紅配制的染液呈酸性，對這種染料具親和性，稱嗜酸性。有時不同的組織結構還需要用特殊的染料及染色方法加以顯示，稱特殊染色。
【實驗材料、器具和試劑】
1.材料鯽魚。
2.器具解剖
盤、解剖剪、解剖針、鑷子、紗布、切片機、包埋機、烤片機、毛筆、載玻片、蓋玻片、烤箱、顯微鏡、染色缸、燒杯、量筒。
3.試劑
（1）Bouin液：飽和苦味酸水溶液：甲醛：冰醋酸為15∶5∶1。
（2）蛋白甘油：取雞蛋蛋白充分攪勻，過濾，取濾液10ml，加甘油10ml混勻，再加少量防腐劑（如麝香草酚）混合即成。
（3）Delafield蘇木精甲液：蘇木精1g，無水乙醇6ml乙液：飽和銨明礬水溶液（約10%）100ml丙液：甘油25ml，甲醇25ml先將蘇木精溶于乙醇，再將甲液混合在乙液中，置于白色瓶中并暴露在陽光下約1周，然后過濾，將丙液加入濾液中，待溶液呈暗灰色時再過濾，濾液密封保存。
（4）伊紅乙醇溶液：伊紅0.25g；95%乙醇100ml。
（5）其他試劑：95%乙醇、無水乙醇、鹽酸、二甲苯、石蠟、中性樹膠、生理鹽水等。
【實驗步驟】
1.取材取鯽魚肝、腎組織，切成長、寬、高各2～5mm的小塊，用生理鹽水洗凈。
2.固定上述組織塊用Bouin液固定24h。
3.洗滌固定之后，組織中的固定液必須沖洗干凈。沖洗的方法根據固定液的性狀而確定，固定液為水溶液的常用水沖洗；含有乙醇的用50%乙醇或70%乙醇沖洗；含苦味酸的則用70%乙醇沖洗2次，每次30min。
4.脫水固定的組織經洗滌后，按下列程序進行脫水：70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇各10～20min，無水乙醇（I）和無水乙醇（II）各30～40min。
為了使材料能為石蠟所浸透，必須將水移去，換成能溶解石蠟的有機溶劑，如二甲苯等。在制片中常用的脫水劑是乙醇（酒精），將浸在水中的材料依次從低濃度移到高濃度的乙醇中，最后移到無水乙醇中完成脫水。
5.透明無水乙醇∶二甲苯（1∶1）30min，二甲苯（I）和二甲苯（II）各20min。
無水乙醇不能與石蠟相溶，還需用能與乙醇和石蠟相溶的媒浸液，替換出組織內的乙醇。材料塊在這類媒浸液中浸漬，出現透明狀態，此液即稱透明劑，透明劑浸漬過程稱透明。常用的透明劑有二甲苯、苯、氯仿、正丁醇等，各種透明劑均是石蠟的溶劑。
6.浸蠟與包埋在55～60℃下，組織塊在二甲苯∶石蠟（1∶1）、石蠟（I）和石蠟（II）中各置30min。
用熔化的石蠟取代二甲苯,使材料逐步為純石蠟所浸透。
然后將材料連同熔化的石蠟，倒入小紙盒中，在室溫下或在冷水中使包埋有材料的蠟塊迅速凝固。浸蠟和包埋的目的是使材料借石蠟的支持能被切成薄片。
7.切片、貼片修整蠟塊、切片，用蛋白甘油貼片，貼好的切片置于37℃恒溫箱內干燥2～3h。
貼片時，用蛋白甘油作為黏附劑，將展平的蠟片黏附于載玻片上，以免在以后的脫蠟、水化及染色等步驟中兩者脫離。
8.HE染色、封片干燥后的切片需脫蠟及水化才能在水溶性染液中進行染色。用二甲苯脫蠟，再逐級經無水乙醇及梯度濃度乙醇直至蒸餾水。染色后的切片尚不能在顯微鏡下觀察，需經梯度濃度乙醇脫水、二甲苯透明后，滴加適量（1～2滴）中性樹膠，封片后即制成永久性玻片標本，在光鏡下可長期反復觀察。
將干燥的切片放入染色缸中，按下列程序進行染色和封片：二甲苯脫蠟10～20min，無水乙醇∶二甲苯（1∶1）、無水乙醇（I）、無水乙醇（II）、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇和50%乙醇各3～5min；蒸餾水洗片刻，蘇木精染10～15min（隨時鏡檢），自來水洗10min（切片顯示藍色），置1%鹽酸乙醇中分色數秒（切片變紅，顏色變淺即可），自來水洗數秒，蒸餾水洗2次；然后置70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇和95%乙醇各3～5min，伊紅Y染色30～60s；95%乙醇、無水乙醇（I）和無水乙醇（II）各3～5min，無水乙醇∶二甲苯（1∶1）8～10min，二甲苯（I）和二甲苯（II）各5min；中性樹膠封片。
9.觀察觀察組織及細胞結構。
【注意事項】
1.取材應根據要求選取材料來源及部位。材料必須新鮮，擱置時間過久則使蛋白質分解變性，導致細胞自溶及細菌的滋生，而不能反映組織活體時的形態結構。切取的組織塊不能太大，否則不利于固定液迅速滲透組織塊。
2.固定用適當的化學藥液―固定液浸漬切成小塊的新鮮材料，迅速凝固或沉淀細胞和組織中的物質成分，終止細胞的一切代謝過程，防止細胞自溶或組織變化，盡可能保持其活體時的結構。固定能使組織硬化，有利于切片的進行，而且也有媒浸作用，有利于組織著色。固定液的種類很多，其對組織的硬化收縮程度以及對組織內蛋白質、脂肪、糖類等物質的作用各不相同。因此，應根據所要顯示的內容來選擇適宜的固定液。
【作業與思考】
1.總結和分析實驗過程中遇到的問題及其解決方法。
2.分析影響HE染色的主要因素。