microRNA鑑定與功能分析技術（簡體書）

《microRNA鑒定與功能分析技術》綜合國內外有關microRNA研究的進展，首先介紹了microRNA的發現歷程、生物起源及加工成熟的機制、特征及鑒別等，然後在闡述microRNA作用機制的基礎上，詳細介紹了microRNA的調控機理及其在生理、病理進程中的功能，并著重探討了幾種主要非編碼RNA的區別。隨後，重點介紹microRNA的研究方法，涉及生物信息學分析方法與分子生物學方法，前者包括microRNA相關的數據庫及序列信息獲取、microRNA基因簇的分析策略、種系發育分析策略以及microRNA的轉錄調控等；後者則包括新microRNA基因的探索與克隆、microRNA的表達分析方法、microRNA表達干預方法以及功能研究策略等。最後編者根據自己的工作實踐，系統介紹了microRNA相關研究方法在肝細胞癌研究中的應用。
《microRNA鑒定與功能分析技術》具有理論結合實際、系統性強等特點，由子取材新穎、圖文并茂，對從事microRNA研究同行具有較高的參考價值，適合從事生命科學研究的科研人員及高等院校師生閱讀。

《microRNA鑒定與功能分析技術》是生物實驗室系列之一。

基因組測序計劃的完成標志著生命科學研究進入了一個新時代，但是基因組測序呈現給世人的是大量繁雜的序列信息，讀懂這些信息便是“後基因組時代”的主要任務。基因組內的信息除了蛋白質編碼基因之外，還有大量的非編碼序列，此類隱藏的基因過去一直被認為是基因組內的“垃圾”。然而，隨著研究的深入，科研工作者發現非編碼基因同樣具有重要的生物功能。microRNA便是基因組內的隱藏信息，近年來研究發現,此類非編碼RNA分子具有重要的調控功能。這種調控作用遍及生命體的各種活動中，如生物體生長發育、器官形成、細胞增殖分化及凋亡以及多種疾病的發生等。因此，近年來microRNA備受矚目，并迅速成為生命科學領域中的研究熱點。
生命活動非常復雜，即使是最簡單的事件也需要大量基因參與，而參與其中的基因則以不同形式的產物發揮作用。既有中心法則所提及的終極產物蛋白質，又有近年來發現的非編碼RNA分子、基因表觀遺傳效應等隱藏的信息。microRNA便是非編碼RNA分子中的重要成員，以前被認為是基因組中的垃圾，現在看來則是珍寶。它的存在可以解釋許多生命活動的奧秘以及許多疑難疾病的發生機制。然而，microRNA如何發揮其調控功能還不清楚，因此，要闡述其在生理、病理狀態中發揮什么作用以及如何發揮作用，則需要深入研究microRNA的功能。大多數microRNA是由基因間DNA序列編碼的，轉錄方向與相鄰的基因往往相反，是與基因表達不同的獨立單位。另一類microRNA則位于蛋白質編碼基因的內含子序列中，隨mRNA一起轉錄，包含在mRNA前體轉錄物中，此類microRNA往往具有組織特異性。
microRNA基因由RNA聚合?Ⅱ轉錄，產生原始microRNA轉錄物（primicroRNA），primicroRNA在細胞核內經一種稱為Drosha的RNA內切?Ⅲ加工，得到microRNA前體（premicroRNA）。該前體被Exportin5蛋白以分解GTP能量的方式運輸到細胞質中，再經第二種RNA內切?ⅢDicer進一步加工得到約22個核?酸的成熟雙鏈RNA分子，其中一條成熟鏈插入RNA誘導沉默復合物（RISC），作用于其靶基因的3′非翻譯區內調控位點，從而影響靶基因的翻譯。目前在生物體內已發現1000余種microRNA分子，這些分子在不同物種之間具有序列保守性，據推測可能有5000個以上基因受到microRNA調控，這些靶基因參與人類各項生命活動，這說明microRNA對人類生命活動的調控是強有力的。因此，研究microRNA在人類重大疾病發生中的調控作用，具有重要的理論意義和實際意義。目前microRNA研究主要集中于microRNA加工成熟機制以及microRNA對其靶基因的調控機制。在生物體內,microRNA主要通過與其靶基因mRNA3′非翻譯區相互作用，在轉錄後水平調控基因表達，進而參與生物體內某些生理及病理過程。并且針對傳統基因的研究方法發展迅速，且已較為完善成熟，為基因功能的進一步研究奠定了基礎。以此類技術為參考，可以發展針對microRNA研究的特殊方法，進而系統闡述microRNA的調控功能。microRNA的研究方法包括新microRNA基因的克隆鑒定、特異microRNA基因的表達檢測及其功能研究等，輔以強有力的工具——生物信息學軟件分析，使全面研究microRNA的功能成為可能。這為獲悉生命活動的真諦以及探求某些疾病發生的機理奠定了堅實的基礎。本書將詳細探討microRNA研究相關技術的原理、適用條件、優缺點以及具體操作步驟等，以期給讀者的實驗工作提供幫助。
本書包括四部分，分為microRNA基本知識概述、生物信息學研究方法、分子生物學研究方法以及相應方法的實際應用等。在概述部分，主要介紹microRNA的發現歷程及生物起源，microRNA的特征及鑒別分析，microRNA的調控機理與生物功能以及幾種常見非編碼RNA的異同等。在生物信息學研究方法部分，主要介紹了目前microRNA研究常用的幾種在線生物信息學分析軟件，而在分子生物學研究方法部分則介紹了十余種有關microRNA克隆、表達分析、表達干預及分子機制研究等方法，并將microRNA預測的生物信息學方法、靶基因預測的分子生物學方法與相應的分子生物學方法綜合介紹，使之更為系統。最後，編者根據自己的研究經歷，通過闡述microRNA21在肝細胞癌發生過程中的功能，系統介紹了microRNA相關方法的實際應用。通過上述安排，讀者在了解microRNA基本概念的同時，可以系統學習microRNA的研究方法并將其應用于自己的研究工作中。
microRNA作為生命科學研究領域內的熱點，發展迅速，新概念、新方法、新成果不斷涌現。隨著時間推移，書中內容必須與時俱進，不斷進行修正與更新，以保持其新穎性和實用性。
化學工業出版社的編輯為本書的出版提供了很大的方便和諸多幫助，特此表示感謝！
本書編著者是科研第一線的工作人員，在承擔繁重科研任務的情況下，仍抽出時間，認真負責地撰稿，并基本達到預期的要求。囿于編著者水平，書中難免出現不妥甚至錯訛之處，希望廣大讀者不吝指正，以便修訂時及時更正。
劉長征余佳
2011年11月

第一章 概述
第一節 microRNA的發現歷程
第二節 microRNA的起源與加工成熟
第三節 microRNA的特征和鑒別
第四節 microRNA的調控機理
第五節 microRNA的功能
第六節 microRNA、siRNA、piRNA及其他非編碼RNA
參考文獻

第二章 microRNA的生物信息學研究方法
第一節 microRNA的生物信息學分析策略概述
第二節 microRNA序列信息的獲取及相關數據庫的建立
第三節 microRNA簇的分析策略
第四節 microRNA的種系發育分析
第五節 microRNA基因的轉錄調控分析
參考文獻

第三章 microRNA的分子生物學研究方法
第一節 microRNA表達分析方法
第二節 microRNA體外或體內水平的過表達研究
第三節 microRNA表達抑制研究
第四節 體外驗證microRNA作用的靶基因
第五節 microRNA功能研究的策略
參考文獻

第四章 microRNA新基因的預測、克隆鑒定及注冊
第一節 microRNA新基因的預測及注冊程序
第二節 microRNA新基因的克隆及鑒定方法
參考文獻

第五章 microRNA表達分析方法
第一節 microRNA基因芯片分析
第二節 microRNAPAGE/NorthernBlot分析
第三節 microRNA的實時定量PCR檢測
第四節 microRNALNAISH原位雜交
參考文獻

第六章 microRNA表達的干預方法——過表達
第一節 化學合成的microRNAmimics
第二節 真核系統過表達——非病毒載體瞬時表達載體的構建
第三節 microRNA腺病毒過表達系統
第四節 microRNA的慢病毒過表達系統
參考文獻

第七章 microRNA表達的干預方法——表達抑制
第一節 反義核酸分子的抑制策略——化學合成的microRNA抑制劑
第二節 基因水平的抑制策略
第三節 基于病毒表達系統的microRNA抑制策略
參考文獻

第八章 靶基因預測分析及螢光素?雙報告基因系統驗證
第一節 生物信息學預測——microRNA靶基因分析軟件的設計及使用
第二節 螢光素?雙報告基因系統的應用
參考文獻

第九章 microRNA研究方法在肝細胞癌研究中的應用
第一節 microRNA21在肝細胞癌中的功能研究簡介
第二節 microRNA21在肝細胞癌中的功能研究所用實驗材料與方法
第三節 miR21在肝細胞癌發生過程中的表達分析及功能研究
第四節 miR21在肝細胞癌發生及發展過程中的作用機制研究
第五節 miR21通過調控不同的靶基因在肝細胞癌發生過程中所發揮的功能研究
第六節 miR21對重要信號通路及功能基因的影響
第七節 microRNA在腫瘤研究中的分析與展望
參考文獻

按照經典的中心法則，似乎只有蛋白質編碼基因才是真正遺傳信息來源，而存在于基因間或內含子等區域的一些非編碼基因只是基因組內的“垃圾”，不具備生物學功能。但是隨著mi RNA等非編碼RNA基因的發現，這種觀點亟須改變或者進一步完善。有人將非編碼基因看作基因組內的“暗物質”，雖不可見卻發揮著重要的功能。Mi RNA是一種重要的非編碼基因，存在多種生物的基因組內，通過與蛋白質編碼基因序列內的互補序列相結合，在轉錄後水平調控基因的表達，發揮其強有力的生物功能。Mi RNA由RNA聚合?Ⅱ轉錄，經過細胞核內及核外一系列?加工過程，得到20m左右的雙鏈分子。其中一條鏈迅速降解，另一條成熟單鏈分子通過完全互補或部分互補結合于靶基因序列內的調控位點，抑制蛋白質編碼基因的翻譯或以類似RN Ai機制，影響mRNA的穩定性。根據最新的mi RNA Registry Release 15.0的統計，人類基因組內已鑒定1000余個mi RNA，而這些mi RNA可以調控約30％的蛋白質編碼基因。