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白樺基因工程育種（簡體書）
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目次
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009年至今，編者所在團隊在白樺抗逆、材性及生長發育相關基因工程育種方面做了大量的工作。克隆12條白樺基因，構建了過表達及抑制表達載體18個，獲得170余個轉基因株系，對轉基因株系的表型、生理及基因調控機制進行分析，鑒定出了優質、抗逆、早花及葉形變化的轉基因株系。相關成果已發表論文10餘篇，其中SCI論文5篇。基於此，本專著以5篇博士論文、14篇碩士論文為基礎，對白樺基因工程育種進行了總結。
目次
目錄
前言
第一篇 白樺抗旱耐鹽基因工程育種
第1章 轉BpTCP7基因白樺的抗旱耐鹽性研究 3
1.1 BpTCP家族基因的生物信息學分析 3
1.1.1 BpTCP基因的特性分析 3
1.1.2 蛋白質基本結構域的預測 3
1.1.3 BpTCP基因氨基酸序列的同源性分析 4
1.1.4 BpTCP基因系統進化樹 5
1.2 BpTCP基因在白樺不同組織器官表達特性 5
1.3 BpTCP7基因啟動子的表達特性 7
1.3.1 BpTCP7基因啟動子的克隆 7
1.3.2 BpTCP7基因啟動子順式作用元件預測 7
1.3.3 BpTCP7基因組織部位表達特性 10
1.3.4 BpTCP7基因乾旱及鹽應答特性 11
1.4 BpTCP7基因的白樺遺傳轉化研究 11
1.4.1 BpTCP7基因植物過表達載體的構建 11
1.4.2 轉基因白樺的獲得 13
1.4.3 轉基因株系的分子檢測 14
1.5 轉BpTCP7基因白樺的抗旱耐鹽性分析 15
1.5.1 NaCl脅迫處理及生理指標測定 15
1.5.2 PEG脅迫處理及生理指標測定 16
第2章 轉BpSPL9基因白樺的抗旱耐鹽性研究 20
2.1 BpSPL家族基因的生物信息學分析 20
2.1.1 白樺BpSPL基因的特性分析 20
2.1.2 白樺SPL基因的染色體定位分析 21
2.1.3 白樺BpSPL基因氨基酸序列的同源性分析 21
2.1.4 BpSPL基因的系統發育分析 23
2.2 BpSPL基因在白樺不同組織器官表達特性 24
2.2.1 BpSPL基因組織部位表達特性 24
2.2.2 NaCl和PEG脅迫下BpSPL9的應答特性 25
2.3 BpSPL9基因的白樺遺傳轉化研究 26
2.3.1 植物過表達載體的構建 26
2.3.2 轉基因白樺的獲得 29
2.3.3 轉基因株系的分子檢測 29
2.4 轉BpSPL9基因白樺的抗旱耐鹽性分析 31
2.4.1 轉基因植株的耐鹽性分析 31
2.4.2 轉基因植株的抗旱性分析 35
第3章 轉BpCHS3基因白樺的耐鹽性研究 41
3.1 BpCHS3基因生物信息學分析 41
3.1.1 BpCHS3基因開放讀碼框和相似性比對 41
3.1.2 BpCHS3氨基酸序列及理化性質 41
3.1.3 BpCHS3基因系統進化樹 43
3.2 BpCHS3基因的白樺遺傳轉化研究 44
3.2.1 植物表達載體的構建 44
3.2.2 BpCHS3基因過表達株系的獲得 47
3.2.3 白樺BpCHS3基因干擾株系的獲得 49
3.3 轉BpCHS3基因白樺的耐鹽性分析 51
3.3.1 轉基因白樺組培苗的耐鹽性分析 51
3.3.2 田間盆栽轉基因白樺的耐鹽性分析 52
3.4 轉BpCHS3基因白樺的葉片花青素含量比較 53
第4章 轉ThDHN基因白樺的抗旱耐鹽性分析 55
4.1 ThDHN基因的生物信息學分析 55
4.2 ThDHN基因在不同逆境下的表達分析 59
4.2.1 鹽脅迫處理下ThDHN基因在檉柳中的表達 59
4.2.2 乾旱脅迫處理下ThDHN基因在檉柳中的表達 59
4.2.3 冷脅迫處理下ThDHN基因在檉柳中的表達 60
4.2.4 重金屬鎘脅迫處理下ThDHN基因在檉柳中的表達 61
4.2.5 ABA誘導處理下ThDHN基因在檉柳中的表達 61
4.3 ThDHN基因的白樺遺傳轉化研究 62
4.3.1 ThDHN基因植物過表達載體構建 62
4.3.2 轉基因植株的獲得 63
4.3.3 轉基因株系的分子檢測 63
4.4 轉ThDHN基因白樺的抗旱耐鹽性分析 65
4.4.1 轉基因白樺耐鹽性分析 65
4.4.2 轉基因白樺的抗旱性分析 67
第二篇 白樺材性改良基因工程育種
第5章 白樺BpCCR1基因的功能分析 71
5.1 BpCCR1基因的生物信息學分析 71
5.1.1 BpCCR1基因序列相似性比對分析 71
5.1.2 BpCCR1基因的氨基酸序列及理化性質 71
5.1.3 BpCCR1基因系統進化樹 73
5.2 BpCCR1基因的白樺遺傳轉化研究 74
5.2.1 植物表達載體構建 74
5.2.2 轉基因白樺的獲得 76
5.2.3 轉基因株系的分子檢測 77
5.3 轉BpCCR1基因白樺的生長特性及木質素含量測定 79
5.3.1 轉基因白樺的生長特性 79
5.3.2 轉基因白樺的木質素含量和綜纖維素含量分析 82
5.3.3 轉基因白樺的次生木質部結構觀察 83
5.4 轉BpCCR1基因白樺的轉錄組分析 86
5.4.1 RNA質量檢測 86
5.4.2 Illumina/Solexa測序質量統計 87
5.4.3 Unigene注釋分析 88
5.4.4 轉基因白樺Unigene的差異表達 90
5.4.5 差異基因的功能分類分析 90
5.4.6 差異基因的Pathway富集分析 92
第三篇 白樺生長發育相關基因工程育種
第6章 白樺BpIAA10基因的功能研究 101
6.1 BpAux/IAA家族基因的生物信息學分析 101
6.1.1 BpIAA家族基因序列分析 101
6.1.2 BpIAA家族基因的染色體定位及基因結構分析 101
6.1.3 BpIAA蛋白家族的結構及進化關係 104
6.2 BpAux/IAA家族基因在白樺不同組織器官表達特性 106
6.2.1 不同倍性白樺中20條BpIAA基因的時序表達特性 106
6.2.2 四倍體白樺和二倍體白樺中內源激素IAA測定 107
6.3 BpIAA10啟動子功能研究 108
6.3.1 BpIAA10啟動子序列分析 108
6.3.2 BpIAA10啟動子克隆、載體構建及遺傳轉化 109
6.3.3 白樺BpIAA10基因啟動子的表達特性 109
6.4 BpIAA10基因的白樺遺傳轉化研究 113
6.4.1 BpIAA10基因克隆及植物表達載體構建 113
6.4.2 白樺BpIAA10轉錄因子的亞細胞定位 115
6.4.3 轉基因植株的獲得 116
6.4.4 轉基因株系的分子檢測 117
6.5 BpIAA10基因的功能研究 119
6.5.1 BpIAA10基因影響白樺頂端幼葉的發育 119
6.5.2 BpIAA10基因影響白樺休眠芽形成 126
6.5.3 BpIAA10基因參與調控白樺不定根發育 132
6.5.4 BpIAA10基因參與白樺氣孔發育 134
6.5.5 BpIAA10基因參與白樺高生長 134
6.5.6 BpIAA10基因影響白樺功能葉基頂軸方向發育 136
6.6 酵母單雜交和酵母雙雜交篩選BpIAA10啟動子/BpIAA10轉錄因子的互作蛋白 137
6.6.1 白樺cDNA文庫的構建及質量檢測 137
6.6.2 酵母單雜交篩選BpIAA10基因的上游調控因子 139
6.6.3 植物細胞中驗證酵母單雜交篩選結果 141
6.6.4 BpIAA10互作蛋白的篩選 142
6.6.5 雙分子熒光互補（BiFC）在植物細胞內驗證候選蛋白的互作 144
第7章 白樺BpGH3.5基因的功能研究 148
7.1 白樺BpGH3.5基因的生物信息學分析 148
7.2 BpGH3.5基因在白樺不同組織器官表達特性 151
7.2.1 組織表達特異性分析 151
7.2.2 激素及非生物脅迫誘導表達分析 152
7.3 BpGH3.5啟動子的表達特性 152
7.3.1 BpGH3.5啟動子序列克隆 152
7.3.2 BpGH3.5啟動子序列分析 152
7.3.3 BpGH3.5基因啟動子驅動GUS的表達分析 154
7.4 BpGH3.5基因的白樺遺傳轉化研究 155
7.4.1 植物過表達和抑制表達載體的構建 155
7.4.2 轉基因植株的獲得 156
7.4.3 轉基因株系的分子檢測 157
7.5 白樺GH3.5的功能研究 158
7.5.1 轉基因白樺的苗高、地徑調查 158
7.5.2 轉基因白樺生長情況分析 159
7.5.3 轉基因白樺的抗旱性分析 165
7.6 轉GH3.5基因白樺的轉錄組分析 166
7.6.1 Illumina/Solexa測序質量統計 166
7.6.2 Unigene注釋分析 166
7.6.3 差異Unigene的確定及功能分類 168
7.6.4 差異Unigene分析 172
7.6.5 RNA-seq結果的驗證 176
第8章 白樺BpPIN基因的功能研究 178
8.1 白樺BpPIN基因的生物信息學分析 178
8.1.1 構建BpPIN家族進化樹 178
8.1.2 BpPIN基因理化性質分析 178
8.1.3 保守結構域分析 181
8.1.4 跨膜結構域分析 181
8.2 BpPIN基因在白樺不同組織器官表達特性 182
8.2.1 BpPIN基因在白樺葉片不同組織部位中的表達特性 182
8.2.2 BpPIN基因在白樺不同組織器官中的表達特性 183
8.2.3 IAA含量與BpPIN表達的相關性分析 184
8.3 BpPIN1、BpPIN3、BpPIN5啟動子克隆及遺傳轉化 187
8.3.1 pro-BpPIN:: GUS表達載體構建 187
8.3.2 轉BpPIN啟動子白樺的獲得 189
8.3.3 轉BpPIN啟動子白樺的GUS染色 191
8.3.4 pro-BpPIN3:: GUS白樺對IAA及TIBA的應答 191
8.4 BpPIN3基因的白樺遺傳轉化研究 192
8.4.1 BpPIN3基因的獲得與分析 192
8.4.2 植物表達載體的獲得 192
8.4.3 轉基因植株的獲得 195
8.4.4 轉基因株系的分子檢測 196
8.5 轉PIN3基因白樺的功能分析 197
8.5.1 轉基因白樺的苗高、地徑比較 197
8.5.2 轉基因白樺葉型指數比較 197
8.5.3 轉基因白樺根生長特徵比較 199
第9章 白樺BpCUC2基因的功能研究 201
9.1 BpCUC2啟動子的表達分析 201
9.1.1 BpCUC2基因啟動子的獲得 201
9.1.2 Pro-CUC2:: LUC載體的構建 201
9.1.3 轉Pro-CUC2:: LUC白樺的獲得及分子檢測 202
9.1.4 Pro-CUC2驅動的LUC表達特性 202
9.1.5 轉Pro-CUC2:: LUC白樺對激素的應答分析 204
9.1.6 生長素響應元件的上游調控基因的獲得 205
9.2 BpCUC2基因的生物信息學分析 210
9.2.1 BpCUC2基因的獲得 210
9.2.2 BpCUC
前言
第一篇 白樺抗旱耐鹽基因工程育種
第1章 轉BpTCP7基因白樺的抗旱耐鹽性研究 3
1.1 BpTCP家族基因的生物信息學分析 3
1.1.1 BpTCP基因的特性分析 3
1.1.2 蛋白質基本結構域的預測 3
1.1.3 BpTCP基因氨基酸序列的同源性分析 4
1.1.4 BpTCP基因系統進化樹 5
1.2 BpTCP基因在白樺不同組織器官表達特性 5
1.3 BpTCP7基因啟動子的表達特性 7
1.3.1 BpTCP7基因啟動子的克隆 7
1.3.2 BpTCP7基因啟動子順式作用元件預測 7
1.3.3 BpTCP7基因組織部位表達特性 10
1.3.4 BpTCP7基因乾旱及鹽應答特性 11
1.4 BpTCP7基因的白樺遺傳轉化研究 11
1.4.1 BpTCP7基因植物過表達載體的構建 11
1.4.2 轉基因白樺的獲得 13
1.4.3 轉基因株系的分子檢測 14
1.5 轉BpTCP7基因白樺的抗旱耐鹽性分析 15
1.5.1 NaCl脅迫處理及生理指標測定 15
1.5.2 PEG脅迫處理及生理指標測定 16
第2章 轉BpSPL9基因白樺的抗旱耐鹽性研究 20
2.1 BpSPL家族基因的生物信息學分析 20
2.1.1 白樺BpSPL基因的特性分析 20
2.1.2 白樺SPL基因的染色體定位分析 21
2.1.3 白樺BpSPL基因氨基酸序列的同源性分析 21
2.1.4 BpSPL基因的系統發育分析 23
2.2 BpSPL基因在白樺不同組織器官表達特性 24
2.2.1 BpSPL基因組織部位表達特性 24
2.2.2 NaCl和PEG脅迫下BpSPL9的應答特性 25
2.3 BpSPL9基因的白樺遺傳轉化研究 26
2.3.1 植物過表達載體的構建 26
2.3.2 轉基因白樺的獲得 29
2.3.3 轉基因株系的分子檢測 29
2.4 轉BpSPL9基因白樺的抗旱耐鹽性分析 31
2.4.1 轉基因植株的耐鹽性分析 31
2.4.2 轉基因植株的抗旱性分析 35
第3章 轉BpCHS3基因白樺的耐鹽性研究 41
3.1 BpCHS3基因生物信息學分析 41
3.1.1 BpCHS3基因開放讀碼框和相似性比對 41
3.1.2 BpCHS3氨基酸序列及理化性質 41
3.1.3 BpCHS3基因系統進化樹 43
3.2 BpCHS3基因的白樺遺傳轉化研究 44
3.2.1 植物表達載體的構建 44
3.2.2 BpCHS3基因過表達株系的獲得 47
3.2.3 白樺BpCHS3基因干擾株系的獲得 49
3.3 轉BpCHS3基因白樺的耐鹽性分析 51
3.3.1 轉基因白樺組培苗的耐鹽性分析 51
3.3.2 田間盆栽轉基因白樺的耐鹽性分析 52
3.4 轉BpCHS3基因白樺的葉片花青素含量比較 53
第4章 轉ThDHN基因白樺的抗旱耐鹽性分析 55
4.1 ThDHN基因的生物信息學分析 55
4.2 ThDHN基因在不同逆境下的表達分析 59
4.2.1 鹽脅迫處理下ThDHN基因在檉柳中的表達 59
4.2.2 乾旱脅迫處理下ThDHN基因在檉柳中的表達 59
4.2.3 冷脅迫處理下ThDHN基因在檉柳中的表達 60
4.2.4 重金屬鎘脅迫處理下ThDHN基因在檉柳中的表達 61
4.2.5 ABA誘導處理下ThDHN基因在檉柳中的表達 61
4.3 ThDHN基因的白樺遺傳轉化研究 62
4.3.1 ThDHN基因植物過表達載體構建 62
4.3.2 轉基因植株的獲得 63
4.3.3 轉基因株系的分子檢測 63
4.4 轉ThDHN基因白樺的抗旱耐鹽性分析 65
4.4.1 轉基因白樺耐鹽性分析 65
4.4.2 轉基因白樺的抗旱性分析 67
第二篇 白樺材性改良基因工程育種
第5章 白樺BpCCR1基因的功能分析 71
5.1 BpCCR1基因的生物信息學分析 71
5.1.1 BpCCR1基因序列相似性比對分析 71
5.1.2 BpCCR1基因的氨基酸序列及理化性質 71
5.1.3 BpCCR1基因系統進化樹 73
5.2 BpCCR1基因的白樺遺傳轉化研究 74
5.2.1 植物表達載體構建 74
5.2.2 轉基因白樺的獲得 76
5.2.3 轉基因株系的分子檢測 77
5.3 轉BpCCR1基因白樺的生長特性及木質素含量測定 79
5.3.1 轉基因白樺的生長特性 79
5.3.2 轉基因白樺的木質素含量和綜纖維素含量分析 82
5.3.3 轉基因白樺的次生木質部結構觀察 83
5.4 轉BpCCR1基因白樺的轉錄組分析 86
5.4.1 RNA質量檢測 86
5.4.2 Illumina/Solexa測序質量統計 87
5.4.3 Unigene注釋分析 88
5.4.4 轉基因白樺Unigene的差異表達 90
5.4.5 差異基因的功能分類分析 90
5.4.6 差異基因的Pathway富集分析 92
第三篇 白樺生長發育相關基因工程育種
第6章 白樺BpIAA10基因的功能研究 101
6.1 BpAux/IAA家族基因的生物信息學分析 101
6.1.1 BpIAA家族基因序列分析 101
6.1.2 BpIAA家族基因的染色體定位及基因結構分析 101
6.1.3 BpIAA蛋白家族的結構及進化關係 104
6.2 BpAux/IAA家族基因在白樺不同組織器官表達特性 106
6.2.1 不同倍性白樺中20條BpIAA基因的時序表達特性 106
6.2.2 四倍體白樺和二倍體白樺中內源激素IAA測定 107
6.3 BpIAA10啟動子功能研究 108
6.3.1 BpIAA10啟動子序列分析 108
6.3.2 BpIAA10啟動子克隆、載體構建及遺傳轉化 109
6.3.3 白樺BpIAA10基因啟動子的表達特性 109
6.4 BpIAA10基因的白樺遺傳轉化研究 113
6.4.1 BpIAA10基因克隆及植物表達載體構建 113
6.4.2 白樺BpIAA10轉錄因子的亞細胞定位 115
6.4.3 轉基因植株的獲得 116
6.4.4 轉基因株系的分子檢測 117
6.5 BpIAA10基因的功能研究 119
6.5.1 BpIAA10基因影響白樺頂端幼葉的發育 119
6.5.2 BpIAA10基因影響白樺休眠芽形成 126
6.5.3 BpIAA10基因參與調控白樺不定根發育 132
6.5.4 BpIAA10基因參與白樺氣孔發育 134
6.5.5 BpIAA10基因參與白樺高生長 134
6.5.6 BpIAA10基因影響白樺功能葉基頂軸方向發育 136
6.6 酵母單雜交和酵母雙雜交篩選BpIAA10啟動子/BpIAA10轉錄因子的互作蛋白 137
6.6.1 白樺cDNA文庫的構建及質量檢測 137
6.6.2 酵母單雜交篩選BpIAA10基因的上游調控因子 139
6.6.3 植物細胞中驗證酵母單雜交篩選結果 141
6.6.4 BpIAA10互作蛋白的篩選 142
6.6.5 雙分子熒光互補（BiFC）在植物細胞內驗證候選蛋白的互作 144
第7章 白樺BpGH3.5基因的功能研究 148
7.1 白樺BpGH3.5基因的生物信息學分析 148
7.2 BpGH3.5基因在白樺不同組織器官表達特性 151
7.2.1 組織表達特異性分析 151
7.2.2 激素及非生物脅迫誘導表達分析 152
7.3 BpGH3.5啟動子的表達特性 152
7.3.1 BpGH3.5啟動子序列克隆 152
7.3.2 BpGH3.5啟動子序列分析 152
7.3.3 BpGH3.5基因啟動子驅動GUS的表達分析 154
7.4 BpGH3.5基因的白樺遺傳轉化研究 155
7.4.1 植物過表達和抑制表達載體的構建 155
7.4.2 轉基因植株的獲得 156
7.4.3 轉基因株系的分子檢測 157
7.5 白樺GH3.5的功能研究 158
7.5.1 轉基因白樺的苗高、地徑調查 158
7.5.2 轉基因白樺生長情況分析 159
7.5.3 轉基因白樺的抗旱性分析 165
7.6 轉GH3.5基因白樺的轉錄組分析 166
7.6.1 Illumina/Solexa測序質量統計 166
7.6.2 Unigene注釋分析 166
7.6.3 差異Unigene的確定及功能分類 168
7.6.4 差異Unigene分析 172
7.6.5 RNA-seq結果的驗證 176
第8章 白樺BpPIN基因的功能研究 178
8.1 白樺BpPIN基因的生物信息學分析 178
8.1.1 構建BpPIN家族進化樹 178
8.1.2 BpPIN基因理化性質分析 178
8.1.3 保守結構域分析 181
8.1.4 跨膜結構域分析 181
8.2 BpPIN基因在白樺不同組織器官表達特性 182
8.2.1 BpPIN基因在白樺葉片不同組織部位中的表達特性 182
8.2.2 BpPIN基因在白樺不同組織器官中的表達特性 183
8.2.3 IAA含量與BpPIN表達的相關性分析 184
8.3 BpPIN1、BpPIN3、BpPIN5啟動子克隆及遺傳轉化 187
8.3.1 pro-BpPIN:: GUS表達載體構建 187
8.3.2 轉BpPIN啟動子白樺的獲得 189
8.3.3 轉BpPIN啟動子白樺的GUS染色 191
8.3.4 pro-BpPIN3:: GUS白樺對IAA及TIBA的應答 191
8.4 BpPIN3基因的白樺遺傳轉化研究 192
8.4.1 BpPIN3基因的獲得與分析 192
8.4.2 植物表達載體的獲得 192
8.4.3 轉基因植株的獲得 195
8.4.4 轉基因株系的分子檢測 196
8.5 轉PIN3基因白樺的功能分析 197
8.5.1 轉基因白樺的苗高、地徑比較 197
8.5.2 轉基因白樺葉型指數比較 197
8.5.3 轉基因白樺根生長特徵比較 199
第9章 白樺BpCUC2基因的功能研究 201
9.1 BpCUC2啟動子的表達分析 201
9.1.1 BpCUC2基因啟動子的獲得 201
9.1.2 Pro-CUC2:: LUC載體的構建 201
9.1.3 轉Pro-CUC2:: LUC白樺的獲得及分子檢測 202
9.1.4 Pro-CUC2驅動的LUC表達特性 202
9.1.5 轉Pro-CUC2:: LUC白樺對激素的應答分析 204
9.1.6 生長素響應元件的上游調控基因的獲得 205
9.2 BpCUC2基因的生物信息學分析 210
9.2.1 BpCUC2基因的獲得 210
9.2.2 BpCUC
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