內分泌干擾物評估試驗指南（簡體書）

《內分泌干擾物評估試驗指南》一書根據化學物質的內分泌干擾特性、篩查/檢測的試驗指南（TG）或試驗指南草案，指導如何解讀每項試驗的結
果，以及如何在不確定某一物質是否屬于內分泌干擾物的條件下獲取更多的證據；并且為監管機構對特定化學物質及其毒性代謝物的危險狀況的確
定提供指南。

《內分泌干擾物評估試驗指南》適合國內外從事毒理學專業的科技人員、環境保護和環境監測部門的技術人員、毒理學相關專業的在校師生，以及生產化學品廠家的有關
人員學習參考。

目錄
序一
Forward Ⅰ
序二
Forward Ⅱ A指南的簡介與背景 1
A.1目的 1
A.2一般方法 2
A.3范圍與限制 2
A.3.1 涵蓋的測試和內分泌模式 2
A.3.2 評估范圍和單個試驗限制 3
A.3.3 試驗入選原理 4
A.3.4 試驗排除原理 7 B關于內分泌評估與試驗數據選擇的一般指南 9
B.1 針對所指試驗的考慮因素 10
B.1.1 概念框架等級 1：現有數據和非試驗信息 10
B.1.2 概念框架等級 2：體外試驗可提供關于選定的內分泌機制 /途徑的數據 11 目錄
序一
Forward Ⅰ
序二
Forward Ⅱ A指南的簡介與背景 1
A.1目的 1
A.2一般方法 2
A.3范圍與限制 2
A.3.1 涵蓋的測試和內分泌模式 2
A.3.2 評估范圍和單個試驗限制 3
A.3.3 試驗入選原理 4
A.3.4 試驗排除原理 7 B關于內分泌評估與試驗數據選擇的一般指南 9
B.1 針對所指試驗的考慮因素 10
B.1.1 概念框架等級 1：現有數據和非試驗信息 10
B.1.2 概念框架等級 2：體外試驗可提供關于選定的內分泌機制 /途徑的數據 11
B.1.3 概念框架等級 3：體內試驗可提供關于選定的內分泌機制 /途徑的數據 12
B.1.4 概念框架等級 4：體內試驗可提供內分泌相關終點不良作用的數據 13
B.1.5 概念框架等級 5：針對更為廣泛的生物體生命周期內的內分泌相關終點，體內試驗可以提供更為全面的不良作用數據 15
B.2 概念框架的各項試驗中的終點 16 C針對所說明試驗指南的具體指南 25
C.1 具體指南簡介 25
C.2 體外篩檢 26
C.2.1 雌激素受體競爭結合試驗（ US EPA OPPTS 890.1250） 26
C.2.2 雄激素受體競爭結合試驗（ US EPA.OPPTS 890.1150） 38
C.2.3 TG 455：使用穩定轉染人 ERα轉錄激活試驗檢測化學品的雌激素激動劑活性（ER STTA）（包括拮抗作用試驗指南） 50
C.2.4 OECD TG 456：H295R 類固醇合成試驗 62
C.2.5 芳香化酶試驗（ US EPA OPPTS 890.1200） 72
C.3 野生動物篩檢和試驗 82
C.3.1 OECD TG 229：魚類短期生殖試驗（ FSTRA） 82
C.3.2 OECD TG 230：魚類 21天試驗 93
C.3.3 OECD TG 230的變體：雄激素化雌性刺魚篩檢（ AFSS）（GD 140） 100
C.3.4 魚類性發育試驗（ FSDT）（試驗指南草案 234） 107
C.3.5 魚類生命周期毒性試驗（ FLCTT）（USEPA OPPTS 850.1500） 118
C.3.6 OECD TG 231：兩棲動物變態發育試驗（ AMA） 124
C.3.7 OECD TG 206：禽類生殖試驗 132 C4 哺乳動物篩檢和試驗 140
C.4.1 OECD TG 440：嚙齒類動物子宮增重試驗（ UT試驗）（包括關于使用抗雌激素活性篩檢試驗的 OECD指南） 140
C.4.2 OECD TG 441：大鼠中的 Hershberger試驗（H試驗）（包括針對剛斷奶動物 Hershberger試驗的 OECD指南） 149
C.4.3 圍青春期雄性大鼠的青春期發育和甲狀腺功能試驗（雄性動物圍青春期試驗）（US EPA OPPTS 890.1500） 160
C.4.4 圍青春期雌性大鼠的青春期發育和甲狀腺功能試驗（雌性動物圍青春期試驗）（US EPA OPPTS 890.1450） 172
C.4.5 OECD TG 407：嚙齒類動物重復給藥 28天口服毒性研究 183
C.4.6 OECD TG 416：二代生殖毒性研究（包括 TG 415：一代生殖毒性研究） 194
C.4.7 擴展一代生殖毒性研究（ OECD TG 443草案） 204 D 附錄 216
D. 1用于內分泌干擾化學品試驗與評估的 OECD概念框架及其修訂版本 216
D.1.1 簡介 216
D.1.2 原始版本的內分泌干擾化學品試驗與評估的 OECD概念框架（現已廢止） 216
D.1.3 對原始框架文件的注釋 216
D.1.4 2011年 OECD修訂的內分泌干擾物試驗與評估的概念框架 216
D.2主文檔中未包含的試驗的暫行指南 220
D.2.1 體外篩檢 220
D.2.2 野生動物篩檢和試驗 233
D.2.3 哺乳動物篩檢和試驗 253
D.3關于內分泌試驗費用的信息 284
D.4縮略語和術語 286 參考文獻 289

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A 指南的簡介與背景 <br> <br> 1998年，經濟合作與發展組織（ OECD）啟動了一項關于內分泌干擾化學品篩查的高優先度項目，其中包括修改現行指南，以及制定新指南。此后，一些潛在測試已經納入到該指南，不過還有其他一些測試仍然在開發過程中。在“內分泌干擾化學品篩檢的 OECD概念框架（ CF）”中包含了篩查和檢測， 2011年，由內分泌干擾試驗（ EDTA）顧問組對該部分進行了修訂和更新。原始版和修訂版的概念框架均可參見附錄 D.1。2009年 9月 22日至 24日，在哥本哈根召開了“針對內分泌干擾物的檢測、評估和管理的 OECD成員國行動”研討會（ OECD，2010b）。該研討會提出了一項建議：由 EDTA顧問組負責制定內分泌干擾化學品的評估指南［以下簡稱指南（ GD）］。在 2010年 5月 17日至 18日的會議中， EDTA顧問組表示支持這一建議。指南的目標和范圍界定如下：指南可作為監管機構的支持工具，協助解讀試驗結果，針對可實施的附加研究提出建議，以降低不確定性；指南不得提前決定或限制成員國的監管行動，并且不得提供試驗策略建議；指南還應為其他指南提供支持，但不得重復，例如，危險評估指南。應當指出的是，對于哺乳動物和野生動物內分泌干擾引起的毒性（危險和風險評估），很多測定試驗都非常新，因此，如有新的證據，可隨時修訂指南。該指南并非一成不變的文件，可隨著科學的發展而不斷更新。<br> 在本指南的上下文中，世界衛生組織（WHO）（2002）定義的內分泌干擾物（ ED）為：“內分泌干擾物是指能改變內分泌系統功能，從而對生物體整體或其后代或（亞）群體的健康造成不良影響的一種外源性物質或混合物。”WHO也定義了“潛在的內分泌干擾物”為“潛在的內分泌干擾物是指可能導致生物體整體或其后代或（亞）群體分泌干擾物的一種外源性物質或混合物。”眾所周知，還有很多其他的定義（例如， Weybridge Conference，1996），但本指南中將 WHO（2002）定義作為有效的定義，因為該定義中涵蓋了人類健康和野生動物種群。該定義雖應用廣泛，但尚未獲得普遍認可。針對本指南的目的，作者將“可能的內分泌干擾物”一詞定義為：“可能改變內分泌系統功能，但對生物體整體的不良后果尚不明確的化學品。” <br> A.1 目的<br> 本指南的目的如下。<br> 根據化學品的內分泌干擾特性篩查/檢測的試驗指南（TG）或試驗指南草案，收到測試結果后，監管機構可以通過本指南來確定特定化學品及其毒性代謝物的危險狀況。根據地方立法和執法情況，此類決策的背景情況會有所不同，因此對于本指南中所提出的建議，可予以靈活解讀。<br> 本指南指導如何解讀每項試驗的結果，以及如何在不確定某一物質是否屬于內分泌干擾物的條件下獲取更多的證據，但未提供一組試驗策略或試驗程序解讀指南。<br> 本指南中的危險評估方法分為兩個步驟，以便通過 3R原則（實驗動物應遵循替代、減少和優化原則）盡量減少動物試驗的總量。 <br> ○使用統一的框架，評估試驗結果及關于可能或已知危險的現有信息，應避免不必要的動物試驗。 <br> <br> ○當監管機構需要更多證據時可以提供實驗方法方面的建議。應準確界定實驗方法，以便于數據互認，并避免不必要的重復實驗。推薦的實驗方法中將盡量使用非動物試驗，也可根據現有信息，考慮其他的替代情境。 <br> <br> <br> <br> A.2 一般方法<br> 首先本指南中采納的一般方法主要是考慮每項內分泌干擾物響應測試 ①的可能結果，并提供指導，以便根據其他體外或體內試驗中已經獲得或尚未獲得的數據，解讀該結果。在每種情境下，應采用重證據方法(USEPA, 2011; Borgert et al., 2011)，對現有數據和新數據的性質、數量和質量進行評估，并且通常不是只有唯一的“正確”答案。重證據方法可使用其他技術（如基因表達分析或組學數據）來更好地解釋內分泌相關模式和頂端效應之間的關聯。因此，監管機構應根據當地需求靈活應用本指南。其中關鍵問題在于可能的內分泌作用機制，以及可歸因于該作用的“頂端效應”。根據廣泛認可的內分泌干擾化學品的定義（ WHO，2003）表示，如果體內不良作用與內分泌作用模式相關聯，那么該化學品就屬于內分泌干擾物。<br> 其次，本指南提供了關于下一步測試（如需）的建議，監管機構可根據各種已有數據的情境予以采納。應注意的是，本指南只能涵蓋最有可能的情境。在判斷某一化學品是否屬于內分泌干擾物時，本指南所提供的進一步測試的建議通常僅限于接下來的單一步驟，并且本指南沒有針對可能的內分泌干擾物給出整體測試策略。<br> 本指南以表格的形式，對每項測試提出了關鍵建議，其中列出了一系列的情境，綜合了不同的測試結果和現有數據的各種背景，并提供了解讀建議及每種情境條件下可以考慮采用的進一步測試。在解讀每個表格時應結合表格下面的文字，其中說明了表格中由于空間不足而無法詳述的測試相關問題。再次強調，這些表格（被稱為組成部分）僅作為建議，并不要求監管機構必須遵守。更為重要的是，內分泌干擾物試驗指南相對較新，并且該領域很可能會有進一步的發展。 <br> A.3 范圍與限制 <br> A.3.1涵蓋的測試和內分泌模式<br> 指南主要章節的范圍僅限于提供測試結果的解讀，此類測試是指內分泌干擾物測試<br> ①內分泌干擾物響應測試是指可以對內分泌干擾物和（或）可能的內分泌干擾物產生陽性反應的體外和體內試驗。<br> 和評估的 OECD概念框架中包括的測試（參見附錄 D.1）。隨著內分泌干擾領域的發展， <br> OECD的概念框架會進行定期修訂。事實上，在本指南的編寫過程中，概念框架已經被<br> 修訂。根據下文所列的內分泌模式，提供了關于此類測試終點的指南。隨后是關于如何<br> 增加證據，以便基于測試結果和其他現有相關信息，判定某一化學品是或不是內分泌干<br> 擾物。考慮到了各種情境，并且指南中提供了關于不同考慮因素和接下來在單一步驟中<br> 進行試驗的建議。<br> 從內分泌干擾物鑒別的角度，本指南針對概念框架中最為相關的測試提供了詳細的<br> 指南，而對于其他試驗，所提供的指南較為有限（參見附錄 D.2）。指南僅限于內分泌機<br> 制和危險評估，沒有考慮關于化學品暴露方面的信息（例如，用法、用量、致死量、等<br> 級、持續時間和途徑）。<br> 作為概念框架，指南中僅涵蓋了相同的內分泌模態，如下。 <br> ○雌激素受體介導 <br> <br> ○雄激素受體介導 <br> <br> ○甲狀腺激素介導 <br> <br> ○類固醇合成干擾<br> <br> <br> 雖然本指南中的測試適用于目前已知的大多數類型的內分泌干擾物（即通過雌激素/雄激素/甲狀腺素/類固醇合成-EATS-模態起作用），但應該認識到，對于了解較少的化學品類型或作用模式，試驗的響應情況可能較差。例如，雖然在多項哺乳動物試驗中對腎上腺進行了檢查，但是不太可能涵蓋可破壞野生動物皮質類固醇系統的內分泌干擾物（Trenzado et al.，2003），從而可以提供警示。有些內分泌干擾物可能存在后生效應（雖然此類效應并不是僅局限于內分泌干擾物）。Anway和 Skinner（2006）及 Crews和 McLachlan（2006）等對此類潛在效應進行了審評和討論。實質上，后生效應是指：經過幾輪細胞分裂或跨代后出現的表型或基因表達改變的現象，是由于機制作用引起的，而不是基因序列改變所造成的（例如，組蛋白修飾、 DNA甲基化、RNAi介導的基因沉默）。據悉，后生效應可能會導致跨代表型效應，對于通過可能的內分泌干擾物的長期試驗（例如，魚類、禽類和嚙齒類生命周期試驗）是否可以發現所有的潛在后生效應，目前尚不清楚。例如， Brown等（2009）未能在暴露于強效雌激素的雄性虹鱒魚的后代中發現可遺傳的生殖缺陷。目前正在對后生遺傳學領域進行審評，并將于適當時候在 OECD關于內分泌干擾“新終點”的詳細審評文件中出版發行。 <br> A.3.2評估范圍和單個試驗限制<br> 本指南中沒有提供測試策略，僅在建議或提議需要考慮實施進一步檢測時，提供了<br> 單一步驟指南。文件中僅提供了最適用試驗方面的建議，如果國家監管機構需要更多證<br> 據來支持管理決策，可以實施此類試驗，以獲得更多證據。所提出的指南并不是為了鼓<br> 勵實施動物試驗，而是鼓勵盡量使用符合 OECD檢測與評估綜合方法的現有信息（OECD，2008）。對于判斷某一化合物是否具有內分泌干擾作用，多項研究和跨類群終點的相關證據<br> 越多，且證據中包含了不同的生命階段效應和一系列的劑量，其結論的置信度水平會隨之升高。在監管中，判定某一物質是否屬于內分泌干擾物時，所需的證據數量取決于相關監管機構的政策/框架和監管決策環境。例如，在優先級設置決策時，只需要來自特定試驗或組成部分的結果，但對于預測危險或風險評估，僅有這些結果是不夠的。<br> 本指南未提供對于如何實施試驗結果的證明力評價、風險評估或人類健康相關性的判定。OECD（2008，2010b）和 WHO（2007）中提供了一些此類指南。眾所周知，嚙齒類動物中的一些作用機制可能與人類不同，例如，甲狀腺刺激素（ TSH）分泌增多和甲狀腺增生誘導大鼠出現甲狀腺腫瘤，但本指南未對某些與人類具有相關性的機制進行討論。<br> 此外，本指南中沒有說明暴露水平，而在判定是否需要實施進一步檢測以避免不必要的動物試驗時，則需要考慮到暴露水平情況。在野生動物中，尤其需要考慮到暴露水平，其環境風險評估中應對比所有物種的靈敏度，并且只能對風險評估相關的生物體種群實施進一步檢測。與任何評估一樣，最后，也是最重要一點是，應在結論中說明置信度和不確定度。 <br> A.3.3試驗入選原理<br> 在本指南的主體部分，針對概念框架中已經驗證的和（或）廣泛認可的試驗 ①，提供了的詳細指南，并列于表 A.1的 A部分。本文使用的“驗證（validation）”和“已驗證的試驗（validated assays）”等術語的定義可參見 OECD第 34號文件《危險評估的新試驗方法或更新試驗方法的驗證與國際認可的指南》（OECD，2005）（也可參見附錄 D.4<br> “縮略語和術語”）。驗證可以由 OECD或其他組織進行（例如 ICCVAM，機構間替代方法驗證協調委員會）。應注意，本指南使用的“試驗（ assay）”一詞與概念框架中使用的術語相一致，用于表述 OECD（2005）中定義的“試驗方法”，即“試驗方法是指一個實驗體系，可用于獲得某一物質的化學性質至不良作用的一系列信息。”對于生態毒性和人類健康研究，可將“試驗方法”與“試驗”這兩個術語互換使用。本指南中使用的<br> “篩檢（screen）”一詞是用于表述體外或體內試驗，提供相關內分泌干擾機制的信息，但不提供關于不良作用的信息，可用于危險或風險評估中。但是，一些監管機構可能希望使用陽性篩檢試驗進行初步的風險評估。另外，“檢測（ test）”一詞涵蓋了體內試驗，可提供證據，用于支持下列結論：某一化學品是內分泌干擾物，可對生物體產生不良作用。例如，篩檢可以是指雌激素受體競爭結合試驗，其中僅測量了體外受體結合活性，不提供不良反應信息；而檢測可以是指青鳉魚多代試驗，其中測量了魚類生殖成功率，提供了不良作用的信息。在 OECD（2005），“篩檢”和“檢測”的定義都較為寬泛，但本指南中，“檢測”一詞的用法更為精確，如需了解所有術語，可參見附錄 D.4“縮略語和術語”。<br> 表 A.1的 B部分中列出的內容有：提供了關于與內分泌系統的潛在相互作用信息，但尚未經過驗證的試驗；或者不是主要用于內分泌干擾物檢測的試驗指南。附錄 D.2中<br> ①此類試驗是指在國家或國際水平上經過確認的試驗，尤其是 OECD試驗指南。