細胞生物學層次化實驗指導（簡體書）

《細胞生物學層次化實驗指導》由南京大學多年從事細胞生物學理論與實驗教學的教師編寫.共收錄55個有代表性的細胞生物學實驗,依據類型、難度、用時等特點對實驗內容進行了歸類和編排,分為三章.第一章編寫了22個基本型實驗,涉及細胞的形態、結構觀察及組成顯示,細胞計數,細胞生理,細胞分裂,細胞裂解及效果檢測,細胞器的分離及細胞融合；第二章為21個綜合型實驗,包括細胞的分離與分選、細胞培養、細胞增殖及細胞活力檢測、細胞黏附與遷移分析、細胞的激活及信號轉導分子檢測、哺乳動物細胞轉基因及表達檢測、細胞週期調控及檢測；第三章為12個開放探索型實驗,涉及細胞凋亡及脹亡的誘導及檢測、細胞自噬的誘導及檢測、細胞衰老的誘導與檢測、細胞分化的誘導及檢測、小干擾RNA 引起的基因沉默、細胞端粒酶活性檢測.此外,還有附錄介 常用溶液的配製、腹水瘤小鼠模型的建立和細胞培養前的準備工作,並附《細胞生物學層次化實驗指導》部分實驗結果彩圖.

導語_點評_推薦詞

第一章基本型實驗
第一節細胞的形態、結構觀察及組成顯示
實驗1血細胞裝片及塗片的製備及染色觀察
實驗2植物細胞的葉綠體、線粒體及液泡觀察
實驗3蟾蜍胸骨劍突軟骨細胞高爾基體的中性紅染色
實驗4馬鈴薯和花生徒手切片的製備及細胞內多醣、脂肪的染色
實驗5孚爾根法顯示細胞中的DNA
實驗6甲基綠—派洛寧染色法顯示細胞中的DNA和RNA
實驗7考馬斯亮藍染色法顯示洋蔥鱗莖內表皮及巨噬細胞的細胞骨架
實驗8酸性磷酸酶法顯示巨噬細胞溶酶體
實驗9細胞中過氧化物酶體的顯示
實驗10酶免疫細胞化學法顯示人T細胞表面CD3分子
實驗11細胞大小的顯微測量
第二節細胞計數
實驗12細胞計數
第三節細胞生理
實驗13哺乳動物紅細胞膜的通透性檢測
實驗14植物細胞質壁分離現象觀察及質壁分離法測定基態滲透值
實驗15小鼠腹腔巨噬細胞吞噬現象觀 及吞噬活性檢測
實驗16台盼藍染料排除法檢測活細胞比率
第四節細胞分裂
實驗17壓片法製備植物組織細胞分裂標本片及分裂各期細胞特徵觀察
實驗18滴片法製備動物細胞分裂標本片及細胞分裂指數分析
第五節細胞裂解及效果檢測
實驗19小鼠腹水瘤細胞裂解及乳酸脫氫酶活性檢測
第六節細胞器的分離
實驗20植物細胞葉綠體的分離
實驗21動物細胞線粒體的分離
第七節細胞融合
實驗22 PEG介導的細胞融合
參考及拓展閱讀文獻
第二章綜合型實驗
第一節細胞的分離與分選
實驗23密度梯度離心法分離血液單個核細胞
實驗24免疫磁珠分選法分離小鼠脾臟CD4+T淋巴細胞
實驗25 T細胞的免疫熒光標記及流式細胞儀分選
第二節細胞培養
實驗26貼壁細胞的原代培養
實驗27貼壁細胞的傳代培養
實驗28細胞凍存與解凍復甦
實驗29動物外周血細胞培養及染色體製備
三節細胞增殖及細胞活力檢測
實驗30 MTT比色法檢測細胞增殖與活力
實驗31 CCK—8法檢測細胞增殖與活力
第四節細胞黏附與遷移分析
實驗32腫瘤細胞黏附能力分析
實驗33檢測腫瘤細胞侵襲能力的Transwell小室實驗
實驗34腫瘤細胞遷移的划痕實驗（wound scratch assay）
第五節細胞的激活及信號轉導分子檢測
實驗35利用鈣離子熒光探針檢測細胞內Ca2+濃度
實驗36信號蛋白磷酸化水平檢測
實驗37轉錄因子NF—kB活性檢測
第六節哺乳動物細胞轉基因及表達檢測
實驗38綠色熒光蛋白基因轉染體外培養的小鼠成纖維細胞及表達檢測
第七節細胞週期調控及檢測
實驗39利用流式細胞術分析細胞週期時相
實驗40細胞週期蛋白Dl基因轉染細胞及細胞週期檢測
實驗41胸腺嘧啶脫氧核苷（TdR）雙阻斷法同步化培養動物細胞
實驗42秋水仙胺阻抑法分離貼壁培養的哺乳動物M期細
實驗43植物細胞中期同步化誘導
參考及拓展閱讀文獻
第三章開放探索型實驗
第一節細胞凋亡及脹亡的誘導及檢測
實驗44凋亡細胞及脹亡細胞的形態學檢測
實驗45 Annexin V —FITC／PI雙染色法檢測凋亡與脹亡細胞
實驗46凋亡細胞DNA的電泳檢測
實驗47 TUNEL技術原位檢測凋亡細胞DNA斷裂
第二節細胞自噬的誘導及檢測
實驗48 MDC染色法檢測巨噬細胞自噬現象
實驗49 GFP—LC3基因轉染法顯示自噬體
第三節細胞衰老的誘導與檢測
實驗50細胞ROs的流式細胞儀檢測
實驗51 H2O2誘導細胞衰老及胞內衰老相關的β—半乳糖苷酶檢測
第四節細胞分化的誘導及檢測
實驗52骨髓造血幹細胞的誘導分化
實驗53視黃酸誘導腫瘤細胞分化及檢測
第五節小干擾RNA引起的基因沉默
實驗54 RNA干擾沉默綠色熒光蛋白基因
第六節細胞端粒酶活性檢測
實驗55腫瘤細胞的端粒酶活性檢測
參考 拓展閱讀文獻
附錄一本書常用溶液配製方法
附錄二腹水瘤小鼠模型建立方法
附錄三細胞培養前的準備工作

第一章基本型實驗
第一節細胞的形態、結構觀察及組成顯示
細胞的形態、結構及組成是細胞的基本特性,也是細胞研究的基礎和必要工作.
要對細胞進行觀察,必須先製備細胞標本片.依製片方法及特點不同,製備的細胞標本片有:裝片、塗片、壓片、印片、爬片、鋪片、磨片、徒手切片、冰凍切片、石蠟切片、超薄切片等.其中,裝片、塗片和徒手切片是最常用的製片.
由於細胞的大小(1~30μm)超出人肉眼的分辨率(100μm),對細胞形態及結構的觀察需要藉助於各種顯微鏡.普通光學顯微鏡(光鏡)可觀察超過0.2μm大小的結構,電子顯微鏡(電鏡)可觀察小於0.2μm但大於0.1nm的結構.有自發熒光或熒光染色的結構還可藉助熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡進行觀察.
可利用已知染色試劑及化學反應原位顯示細胞化學組成,並利用顯微鏡進行定性、定位和定量研究.這種研究細胞的 學稱為細胞化學(ytceity),包括細
cohmsr
胞成分的普通染色和熒光染色、酶細胞化學、免疫細胞化學、電鏡細胞化學等.
普通染色指用普通光學顯微鏡可以觀察結果的對細胞結構及組分直接染色的技術.例如,用次甲基藍染料染細胞核,甲基綠吡咯紅染DNA和RNA,Janus gre
n (詹納斯綠B)染線粒體,中性紅染液泡,碘染澱粉,油紅O染脂肪等.
熒光染色指用針對細胞器或細胞化學成分的特異熒光探針對細胞進行染色並
借助熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡觀察結果的技術.如用PI、DAPI、
Hoechst33342等染色.
酶細胞化學是用酶作用於底物,並在無或有其他試劑進一步反應後形成可視沉澱顯示細胞內酶存在及活性的方法.免疫細胞化學(y,ICC)是利用免疫學原理,用熒光
immunocytochemistr素、酶、金屬、發光物質等可視系統標記抗體(或抗原),然後通過特異的抗原抗體反應原位顯示細胞及組織抗原 半抗原成分的方法.根據標記物的不同,免疫細胞化學可分為免疫酶細胞化學技術、免疫熒光細胞化學技術、免疫金銀細胞化學技術、免疫膠體鐵蛋白技術、親和免疫細胞化學技術及免疫電子顯微鏡技術等,標記物分別為酶、熒光素、膠體金、膠體鐵、親和配體等.其中的免疫酶細胞化學技術和免疫熒光細胞化學技術最為常用.檢測範圍非常廣,包括各種蛋白質、多肽、核酸、部分類脂、多醣等.
電鏡細胞化學是從光鏡細胞化學的基礎上發展起來的一種超微結構顯示技術,是利用特定的化學顯色反應,形成高電子密度、不溶性的反應產物沉澱在細胞原位,借助電子顯微鏡進行超微結構的原位分析.其中包括免疫電鏡技術、電鏡酶細胞化學技術等.
實驗1血細胞裝片及塗片的製備及染色觀察
裝片法是一種最為簡單、最為常用的生物組織及細胞玻片標本製備方法.其是 微小的生物或從生物體上撕下、挑取少量的材料封裝於載玻片與蓋玻片之間製成的標本.其基本上保持了細胞的原有形態及狀態.動物細胞懸液,藻類、菌類、蕨類的原葉體、孢子囊,纖細的苔蘚植物,被子植物的表皮、花粉粒,幼小動物等都可用裝片法製備標本.
塗片法是指將細胞懸液均勻地塗佈在載玻片上製備的細胞標本,可用於製備各種細胞懸液的可保存光學顯微鏡標本片.培養的各種懸浮細胞及醫學臨床標本血液、骨髓、痰液、羊水、生殖道分泌物、胸腹腔滲出液等都可用塗片法製備標本.

實驗原理
適當稀釋的綿羊抗凝血及大腸桿菌菌液,製成裝片後細胞密度適宜,可在顯微鏡下觀察其細胞形態.
用推片法將血液製成薄的血塗片,可使血細胞成單層排列.用含天青和伊紅的複合染料如瑞氏染液進行染色時,細胞中的鹼性物質如紅細胞中的血紅蛋白及嗜酸性粒細 胞質中的嗜酸性顆粒等與酸性染料伊紅結合染成紅色；細胞質中的嗜鹼性顆粒與鹼性染料次甲基藍結合染成藍色；中性粒細胞的中性顆粒呈等電狀態,與伊紅和美藍均不能很好地結合,因此染成淡紫紅色.

實驗材料、試劑及器材
1.材料
(1)小鼠血
:肝素抗凝,心臟採血,用0.9％氯化鈉生理鹽水稀釋1000倍.

(2)大腸桿菌菌液
:大腸桿菌DH5α ,液體LB培養基培養過夜,用0.9％

氯化鈉生理鹽水稀釋20倍.
(3)新採集小鼠血.採集時需加肝素鈉溶液抗凝.
2.試劑
(1)0.9％氯化鈉生理鹽水.
(2)肝素鈉溶液:用生理鹽水配成180IU /mL.
(3)瑞氏(Wright.s)染液:瑞氏染料粉末0.1 g和甲醇60mL .配法:把染料放在研缽內,加少量甲醇研磨,使染料溶解,然後把溶解的染料倒入乾淨的棕色玻璃瓶,並至用完甲醇為止.
( 4)pH6.4的PBS:磷酸二氫鉀(無水)0.3 g,磷酸氫二鈉(無水)0.2 g,先加800mL蒸餾水溶解,調pH至6.4 ,再補加蒸餾水 1000mL .
3.儀器和用具
普通光學顯微鏡、載玻片及蓋玻片、酒精棉球、蠟筆、膠頭吸管、1.5mL EP管、吸水紙、擦鏡紙等.

實驗操作
(一)細胞裝片的製備及觀察技巧。細胞裝片的製備
1取載玻片,用膠頭滴管向其中央位置分別滴加1000倍稀釋的羊血細胞懸液和20倍稀釋的大腸桿菌菌液懸液,加蓋玻片,製成裝片.對於初次觀察的細胞樣品,可滴加較多量(1個自然滴,約50 μL)的細胞懸液,使標本較厚,在顯微鏡下調焦時可通過尋找流動的液體判斷細胞層,確保所觀察到的物體為細胞懸液中的細胞；當對細胞形態有了初步認識後,如要進一步觀察細胞形態結構,可滴加適量(以加蓋玻片後細胞懸液恰好佈滿整個蓋玻片下面為原則)細胞懸液.為了避免加蓋玻片時產生氣泡,可先讓蓋玻片一側邊緣接觸液滴邊緣,待液滴沿蓋玻片邊緣展開後,隨液體擴散緩慢放下蓋玻片.
2.顯微觀察技巧
旋轉物鏡轉換器到10×物鏡,先將粗調焦螺旋外旋,使標本升至最高點,然後一邊用眼睛通過目鏡觀察標本,一邊逐漸向內旋轉粗調焦螺旋,直至視野中出現晃動的液體,觀 測細胞即在其中.如視野中細胞太小,轉換物鏡至40×高倍鏡,一般稍微向外旋轉微調焦螺旋即可看到清晰的物像.
(二)血細胞塗片的製備、染色及觀察
1.清潔載玻片
使用前,必須仔細清洗,並用軟布或脫脂棉蘸取70％乙醇清潔.目的是便
於製片均勻；避免酸鹼物質對染色的影響.
2.加樣
用膠頭滴管加1小滴(約10 μL)細胞樣品於載玻片長軸一端離邊緣約1cm處中央.
3.推片
將有樣品的載玻片A放在實驗台等平坦地方,右手持另一張載玻片B作為推片,用一側短邊邊緣接觸血滴前沿,待血滴沿載玻片B邊緣展開後,使載玻片B以與載玻片A呈30 °~45 °角向前勻速移動,將血液推成厚薄適宜的血塗片.
4.干片
(1)空氣乾燥:在空氣中晃動血塗片,使其迅速乾燥.
(2)加熱乾燥:握住塗片,在距離酒精燈火焰上方約5cm處晃動,加熱乾燥.
5.選區
在顯微鏡下觀察,選取細胞分散良好、分佈均勻的血膜作為 色區域,用蠟筆劃圈(3cm×2 cm)作堤防,將欲染色區域圍起來,防止染色時染料快速在載玻片上擴散而乾掉.
6.染色
用瑞氏染液染色.方法:先滴加適量瑞氏染液覆蓋選定區域,等1m in；再滴加等量pH6.4的PBS稀釋染液,輕輕旋轉載玻片混勻,液面應浮現一層黃色金屬樣物質,然後靜置染色15 ~20m in.
7.洗去多餘染液
不要倒掉染液,直接用流水或滴加蒸餾水洗去浮液,自然晾乾或用吸水紙吸乾.
8.封片
如要保存留用,可滴樹膠加蓋片封固.
9.顯微觀察結果
1)裝片標本
視野中主要為小鼠紅細胞,呈圓形,胞質均勻；另外,可以看到表面呈毛刺樣的粒細胞、較大且胞質中有顆粒的單核細胞等；大腸桿菌為長短不一的桿狀細胞.
2)小鼠血細胞塗片標本
紅細胞圓餅狀無核,中間薄,周圍厚；數量最多,佈滿整個視野.
淋巴細胞基本圓形,比紅細胞稍大.核深染且幾乎佔據整個細胞,一側常有小凹陷；質色淡,很少,僅在細胞核外有一薄圈.數量為白細胞中最多,通常超過70％ .
單核細胞最大,少；胞體圓形或橢圓形；核常偏位,形態多樣(卵圓形、腎形、馬蹄形等)；胞核著色比淋巴細胞核淺；核質比小於淋巴細胞.數量通常不到白細胞總數的1％ .
中性粒細胞形態不規則,外周常有突起；核臘腸狀或分葉狀(2~5葉),胞質顆粒細小,染色淺.數量在白細胞中僅次於淋巴細胞,通常超過白細胞總數的20％ .
嗜酸性粒細胞胞體圓形,直徑為10 ~15 μm,胞核常為2葉,胞質充滿粗大的紅色顆粒.數量佔白細胞總數的2％左右,隨品種與鼠齡不同有較大變化.
嗜鹼性粒細胞細胞呈球形,直徑10 ~12 μm；胞核不規則,分葉或呈S形,著色較淺；胞質內有大量深染的嗜鹼性顆粒,有時將核覆蓋.數量極少,很難找到.
血小板最小(2~4μm ),多角形,聚集成群.

注意問題
1.塗片用血量需適宜,太多容易導致標本過厚、細胞重疊,不便觀察,也會因乾燥過慢、緩慢失水造成細胞皺縮變形；太少容易導致血膜太薄、細胞太稀,不便觀察.
2.血塗片需乾透後再進行染色,否則細胞在染色過程中容易脫落.
3.用蠟筆作堤防時畫的圈要完整,以免染料從缺口處流失.
4.沖洗時不能先倒掉染液,以防染料沉著在血塗片上；沖洗時間不能過久,以防脫色.如血塗片上有染料顆粒沉積,可滴加甲醇,然後立即用流水沖洗；如染色不夠,可補染,染色時先加PBS後加瑞氏染液.
5.注意染液及沖洗液的pH.瑞氏染色適宜pH為6.4 ~6.8 ,染液偏酸或偏鹼均可使細胞染色反應異常,不好辨認.

作業與思考題
1.根據觀察結果,畫圖顯示小鼠各种血細胞.2.若製備細胞塗片的細胞懸液樣品濃度過小,製片前需要作何預處理?

拓展實驗
分別用等量1mo l/L HCl和1mo l/ L NaOH溶液與pH6.4的PBS混合後再稀釋瑞氏染液染色血細胞塗片,觀察染色環境 酸和偏鹼對於染色效果的影響.
實驗2植物細胞的葉綠體、線粒體及液泡觀察
活體染色是指對生活有機體的細胞或組織能著色但又無毒的一種染色方法.意義是:便於觀察活細胞內相關結構的變化.具體染色方法有:體內活染和體外活染(超活染色).體內活染動物細胞時,常用注射法將染料注入動物體內；體內活染植物細胞時,可將染液加在培養基中.常用染料有:詹納斯綠B (Janus gre
n)、中性紅(neutralred)、亮焦油紫、次甲基藍、尼羅藍(Nileblue)等.詹納斯綠B和亮焦油紫都可用於線粒體染色,前者主要用於體外活染,後者可用於體內活染.中性紅用於染液泡系,包括動物細胞的吞噬泡、食物泡、植物細胞的液泡等；中性紅體內體外兼可用.次甲基藍可用於染神經組織.尼羅藍可染原生動物的大核.

實驗原理
將撕取的植物葉下表皮製備成裝片,可看到氣孔及保衛細胞、副衛細胞、柵欄細胞等,柵欄細胞內的葉綠體較多而大,可不經染色而在普通光學顯微鏡下直接觀察.細胞內的線粒體可被線粒體特異活體染料詹納斯綠B染色呈現藍綠色,液泡可被液泡系特異活體染料中性紅染色而呈紅色.兩種染料染色的原理是:中性紅為弱鹼性染料,專一在酸性的細胞器中積累,在中性或微鹼性環境中,活細胞的液泡吸收中性紅,進入液泡的中性紅在酸性環境中解離出陽離子而呈現紅色；詹納斯綠B可被線粒體的細胞色素氧化酶氧化成藍綠色.

實驗材料、試劑及器材
1 .材料
青菜.
2.試劑
(1)0.04％中性紅生理鹽水溶液:先配成1％中性紅水溶液,再用蒸餾水將1％中性紅水溶液稀釋成0.04％溶液,盛於棕色瓶中,暗處保存. (2)0.02％詹納斯綠B生理鹽水液:先配成1